1.试验所需仪器设备及试剂
(1)仪器
仪器名称 | 规格型号 |
生物安全柜 | BSC-1500ⅡA2-X |
CO2细胞培养箱 | BC-J160S |
荧光倒置显微镜 | DS-Ri2 |
高速冷冻离心机 | Multifuge X1R |
电热恒温鼓风干燥箱 | DHG-9123A |
电热恒温震荡水槽 | DK-2B |
(2)试剂耗材
试剂名称 | 规格/货号 |
T25细胞培养瓶 | 430639 |
血球计数板 | Neubauer improved |
24孔板专用细胞爬片 | YA0350 |
细胞培养孔板 | WHB-24 |
胎牛血清 | 1414426 |
成纤维细胞专用培养基 | Primed-iCell-003 |
多聚甲醛(PFA) | P1110 |
DAPI | C0060 |
Triton X-100 | T8200 |
山羊血清 | SL038 |
Vimentin | 10366-1-AP |
Fluoromount-G荧光封片剂 | 0100-01 |
2.人真皮成纤维细胞(A)的分离培养
1) 将手术中取出的组织置于无菌PBS缓冲液中低温运输,
2) 在超净工作台内取出组织,用75%酒精浸泡2min左右,置于含有P/S的PBS中,
3) 将组织块剪成边长约为0.1cm的正方形,反复清洗后弃上清,置于含有完全培养基的培养皿中,37℃孵育30~60min,
4) 用镊子夹入培养瓶中,倒置于5%CO2培养箱中孵育2h,
5) 分别加入2ml成纤维细胞完全培养基,浸润组织块,但不能使组织块漂浮,置于5% CO2细胞培养箱中,
6) 每隔3天换液,待组织块周围生长的细胞融合成片,即可去除组织块, 用胰蛋白酶消化细胞,重新铺瓶。
细胞培养图片如下:
100x 200x
原图见文件-细胞培养
3.免疫荧光鉴定
3.1实验步骤
(1)细胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中,每孔加入培养基1mL,加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。
(2)固定
细胞爬片后,吸出培养基,用PBS洗1遍,加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS,放4℃过夜。
(3)破膜封闭
将玻片除去水分,置于培养皿支撑物上,
玻璃片封闭液配置:0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合,再加10% 血清,
取50uL破膜封闭液滴于防水膜上,将玻片上有细胞的一面盖上2h。
(4)一抗孵育
一抗配制:抗体与PBS 1:100(200)稀释
破膜封闭后,取50uL一抗于防水膜上(湿盒中),将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃(最多可放置一周)
(5)二抗孵育
室温避光孵育二抗(二抗:PBS=1:500)2h后,PBS洗3×5min/次,染DAPI(DAPI:PBS=1:1000)5min,PBS洗3×5min/次。
(6)包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G,将有细胞的一面盖上。
鉴定细胞为P1代细胞
3.2免疫荧光鉴定结果
100X-DAPI 100X-fluorescence
200X-DAPI 200X-fluorescence
原图见文件-免疫荧光
4.转染
4.1SV40过表达慢病毒基本信息
实验信息表: | ||||
产品名称 | SV40过表达慢病毒 | |||
载体信息 | 载体元件信息 | EF1α-SV40-IRES-puromycin | ||
携带荧光标记 | GFP □ RFP□ | 抗性基因标记 | Puromycin □ Blasticidin □ | |
载体图谱 |
| |||
载体目的序列信息如下: gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaatgaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaacaagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgtttaaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgccaacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggatataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaaaatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtggggggaaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggaggggagtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaaagaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagattatttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagtttgctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattggagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcagggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaatctagacacagtgcagcactctcaacgttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc 黄色区域为目的序列区 |
4.2转染
(1)将细胞接种6孔板,每孔细胞数约为1×105 个,
(2)第二天,待细胞贴壁后,换液,
(3)加入1mL完全培养基,再加20 μL SV40过表达慢病毒,
(4)混匀后继续培养,
(5)12h后观察细胞状态,并更换为新鲜培养基,
(6)当细胞长满板底后,传代至T25培养瓶中。
5.筛选
5.1杀灭曲线的确定
(1)将未转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板,孵育过夜,
(2)第二天,除去24孔板中旧的培养基,
(3)将含不同浓度嘌呤霉素(1ug/mL,2ug/mL,3ug/mL,4ug/mL,5 ug/mL,6ug/mL,7ug/mL)的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板,
(4)每2天更换新鲜的筛选培养基,
(5)每天观察细胞的存活比例,
(6)最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度。
结果:嘌呤霉素的使用浓度为3ug/mL,作用时间2d。
5.2嘌呤霉素筛选转染细胞
(1)第一天,将转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板,孵育过夜
(2)第二天,除去24孔板中旧的培养基,
(3)加入含嘌呤霉素(3ug/mL)的筛选培养基,孵育,
(4)每2天更换新鲜的筛选培养基,
(5)每天观察细胞的存活比例,
(6)在同一时间点(2d)存活的细胞,即为转染成功的细胞,
(7)对筛选后的细胞进行扩增。
6.细胞扩增
将筛选后的细胞进行扩增,筛选后的细胞为P1代,扩增至少到12代。
永生化的细胞图片如下:
100X 200X
原图见文件-永生化