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人眼睑真皮成纤维细胞(A)永生化分离培养及鉴定、转染方法
作者:    日期:2024-07-01

1.试验所需仪器设备及试剂

(1)仪器

仪器名称

规格型号

生物安全柜

BSC-1500ⅡA2-X

CO2细胞培养箱

BC-J160S

荧光倒置显微镜

DS-Ri2

高速冷冻离心机

Multifuge X1R

电热恒温鼓风干燥箱

DHG-9123A

电热恒温震荡水槽

DK-2B

(2)试剂耗材

试剂名称

规格/货号

T25细胞培养瓶

430639

血球计数板

Neubauer improved

24孔板专用细胞爬片

YA0350

细胞培养孔板

WHB-24

胎牛血清

1414426

成纤维细胞专用培养基

Primed-iCell-003

多聚甲醛(PFA)

P1110

DAPI

C0060

Triton X-100

T8200

山羊血清

SL038

Vimentin

10366-1-AP

Fluoromount-G荧光封片剂

0100-01

2.人真皮成纤维细胞(A)的分离培养

1) 将手术中取出的组织置于无菌PBS缓冲液中低温运输,

2) 在超净工作台内取出组织,用75%酒精浸泡2min左右,置于含有P/S的PBS中,

3) 将组织块剪成边长约为0.1cm的正方形,反复清洗后弃上清,置于含有完全培养基的培养皿中,37℃孵育30~60min,

4) 用镊子夹入培养瓶中,倒置于5%CO2培养箱中孵育2h,

5) 分别加入2ml成纤维细胞完全培养基,浸润组织块,但不能使组织块漂浮,置于5% CO2细胞培养箱中,

6) 每隔3天换液,待组织块周围生长的细胞融合成片,即可去除组织块, 用胰蛋白酶消化细胞,重新铺瓶。

细胞培养图片如下:

图片.png 

                               100x                                                   200x

原图见文件-细胞培养

3.免疫荧光鉴定

3.1实验步骤

(1)细胞爬片

取3片玻璃片于24孔板中,每孔加入培养基1mL,加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。

(2)固定

细胞爬片后,吸出培养基,用PBS洗1遍,加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS,放4℃过夜。

(3)破膜封闭

将玻片除去水分,置于培养皿支撑物上,

玻璃片封闭液配置:0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合,再加10% 血清,

取50uL破膜封闭液滴于防水膜上,将玻片上有细胞的一面盖上2h。

(4)一抗孵育

一抗配制:抗体与PBS 1:100(200)稀释

破膜封闭后,取50uL一抗于防水膜上(湿盒中),将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃(最多可放置一周)

(5)二抗孵育

室温避光孵育二抗(二抗:PBS=1:500)2h后,PBS洗3×5min/次,染DAPI(DAPI:PBS=1:1000)5min,PBS洗3×5min/次。

(6)包埋

玻片上各滴1滴Fluoromount-G,将有细胞的一面盖上。

鉴定细胞为P1代细胞

3.2免疫荧光鉴定结果

图片.png 

                    100X-DAPI                                               100X-fluorescence

图片.png 

                       200X-DAPI                                             200X-fluorescence

原图见文件-免疫荧光

4.转染

4.1SV40过表达慢病毒基本信息

实验信息表:

产品名称

SV40过表达慢病毒

载体信息

载体元件信息

EF1α-SV40-IRES-puromycin

携带荧光标记

GFP □   RFP□

抗性基因标记

Puromycin □  Blasticidin □

载体图谱

图片.png 

载体目的序列信息如下:

gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaatgaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaacaagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgtttaaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgccaacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggatataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaaaatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtggggggaaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggaggggagtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaaagaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagattatttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagtttgctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattggagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcagggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaatctagacacagtgcagcactctcaacgttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc

黄色区域为目的序列区

4.2转染

(1)将细胞接种6孔板,每孔细胞数约为1×105 个,

(2)第二天,待细胞贴壁后,换液,

(3)加入1mL完全培养基,再加20 μL SV40过表达慢病毒,

(4)混匀后继续培养,

(5)12h后观察细胞状态,并更换为新鲜培养基,

(6)当细胞长满板底后,传代至T25培养瓶中。

5.筛选

5.1杀灭曲线的确定

(1)将未转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板,孵育过夜,

(2)第二天,除去24孔板中旧的培养基,

(3)将含不同浓度嘌呤霉素(1ug/mL,2ug/mL,3ug/mL,4ug/mL,5 ug/mL,6ug/mL,7ug/mL)的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板,

(4)每2天更换新鲜的筛选培养基,

(5)每天观察细胞的存活比例,

(6)最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度。

结果:嘌呤霉素的使用浓度为3ug/mL,作用时间2d。

5.2嘌呤霉素筛选转染细胞

(1)第一天,将转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板,孵育过夜

(2)第二天,除去24孔板中旧的培养基,

(3)加入含嘌呤霉素(3ug/mL)的筛选培养基,孵育,

(4)每2天更换新鲜的筛选培养基,

(5)每天观察细胞的存活比例,

(6)在同一时间点(2d)存活的细胞,即为转染成功的细胞,

(7)对筛选后的细胞进行扩增。

6.细胞扩增

将筛选后的细胞进行扩增,筛选后的细胞为P1代,扩增至少到12代。

永生化的细胞图片如下:

图片.png 

                                    100X                                                200X 

原图见文件-永生化

合作单位: