一、产品介绍

本试剂盒采用Taqman探针荧光定量PCR法，设计专属探针和关键引物，特异性好，灵敏度高，其最低定量限可以达到3fg/μL水平。DNA参考品制备过程与国家标准品制备完全一致，因此纯度高，无蛋白及离子干扰，经国家标准品浓度校正，保证了待测样品含量检测的准确度。试剂盒提供DNA稀释专用稀释液，单次实验复孔平行性及多次实验间数据重现性好。

二、试剂盒组成

* ROX参比染料为可选，是否使用取决于使用的仪器。具体可参照PART 6中的说明。

三、实验需要但未提供的耗材及设备

四、运输和保存方法

1) 所有组分均干冰运输。

2) 试剂盒需-20℃保存，建议一年内使用完。其中组分B2需避光保存。

3) B2/B3/B4组分在-20℃可以保存两年，B1/B5/B6 组分在-20℃可以保存一年。此外B1/B5/B6 三个组分也可以一起另外购买。

五、实验前准备

1) 使用本试剂前请仔细阅读说明书，所有成分使用前应完全化冻，低速离心，震荡混匀。

2) 从-20℃冰箱取出，将组分B1(2X qPCR Mix)和B6（50X ROX Reference Dye）分别融解，轻轻颠倒（尽量避免产生泡沫），待溶液完全均一后再行使用。注：如B1(2X qPCR Mix)和B6（50X ROX Reference Dye）需一段时间内经常取用，可在2-8度条件下储存3个月。尽量避免反复多次冻融；如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻。

3) B2 (Primer & Probe Mix) and B4 (DNA Control)在使用前混匀时切勿反复吹打，可采用类似清洗管壁方式。注：为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将B4 (DNA Control)分装储存于-20℃。

4) 已融化未使用的B3 (DNA Dilution Buffer)可保存于2-8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-20℃。

5) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作，实验开始前后紫外照射30min以消除环境中潜在的DNA污染源。

6) 由于荧光定量PCR实验有极强的灵敏度，保持工作环境的洁净非常重要，实验开始前建议完全清洁移液器及周边工作环境，移除清理实验过程中用不到的任何物品。

六、操作过程

（一）DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

1) 将试剂盒中的DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上完全融化，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2) 取7支洁净的200μL PCR管，分别标记为S0，S1，S2，S3，S4，S5，S6，每管各加入45μL DNA稀释液。

3)  在标记为S0的PCR管中加入5μL DNA Control (30 ng/μL)，即3000pg/μL，快速离心10 sec，振荡5sec，再快速离心10 sec，该浓度可分装置于-20℃短期保存（不超过3个月），使用时避免反复冻融。

4) S1，S2，S3，S4，S5，S6管稀释操作同S0，稀释方法如下：

（二）反应体系

【注】：

1) 根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+4）*（12.5+2+5.5）μL（含有4孔的损失量），建议冰上操作。

2) 标准品及待测样本每个浓度做 3 个复孔。上述标准曲线的线性范围适用大多数实验，可根据实际需要适当调整。

3) 实验操作应保持一致。加样完成密封好管子后，请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec，如有气泡，需将气泡排尽。

4) 为确保实验结果准确性，建议用1X PBS将溶液中蛋白浓度稀释至1-10mg/ml进行加标回收率实验，确保回收率在50%~150%之间。

5) 几种常见仪器的匹配ROX Reference Dye浓度见下表：

（三）扩增程序设置（2步法）

1) PCR反应的预变性条件必须设定为95℃，15min。

2) 选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“TAMRA”。

3) 变性*：请按照仪器使用说明书对不同型号的仪器进行时间。使用ABI 7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOnePlus时可设定为1sec。

4) 退火/延伸*：请按照仪器使用说明书对不同型号的仪器进行时间。几种常见仪器的时间设定见下表：

七、判定标准

1) 标准曲线：R²>0.99；扩增效率(Eff%)：90%≤Eff%≤110%；斜率（Slope）：-3.8~-3.1。

2) 加标回收率% = (加标样品测定值－样品测定值) /加标理论值*100%，范围50%-150%。

3) 无模板对照（NTC）：即反应体系中用DNA稀释液代替待检测模板，其余成分不变，其检测结果Ct值应为Undetermined或Ct值≥35。